該研究為這一難題提供了全新解決方案：神經(jīng)肽SP（Substance?P）可通過(guò)重塑腸道菌群、促進(jìn)菌群代謝物肌醇生成，同步改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎與焦慮樣行為。這項(xiàng)研究不僅首次闡明了“SP-腸道菌群-肌醇-海馬體信號(hào)通路”的完整調(diào)控鏈，更以多組學(xué)技術(shù)與嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膭?dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其機(jī)制，為IBD合并精神障礙的治療開(kāi)辟了新賽道。百邁客生物為該研究提供了非靶向代謝組和16S?rRNA測(cè)序服務(wù)。

研究背景

炎癥性腸?。↖BD）包含潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病，是一種慢性腸道炎癥疾病，患者焦慮發(fā)生率高達(dá)?30%、抑郁發(fā)生率達(dá)?25%，但腸道外的精神癥狀常被忽視。腸-腦軸介導(dǎo)腸道炎癥與精神癥狀的關(guān)聯(lián)，腸道微生物群及其代謝物通過(guò)腸?–?腦軸調(diào)控腦功能，但硫酸葡聚糖鈉（DSS）誘導(dǎo)的腸道菌群變化如何影響情緒相關(guān)中樞系統(tǒng)尚不明確。

神經(jīng)肽P物質(zhì)（SP）在腸-腦軸各層面均有表達(dá)，已被證實(shí)具有抗炎、神經(jīng)保護(hù)作用，且能改善DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎，但SP是否通過(guò)腸道微生物群調(diào)控腸道屏障功能和中樞神經(jīng)系統(tǒng)以改善焦慮樣癥狀，尚未明確。

研究結(jié)果

SP改善DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎癥狀

該研究采用DSS處理成功誘導(dǎo)出結(jié)腸炎小鼠模型。為評(píng)估SP在結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制中的作用通過(guò)靜脈注射SP干預(yù)，從“腸道病理-腸道屏障-炎癥因子-行為學(xué)”?多維度驗(yàn)證SP的保護(hù)作用。

SP處理顯著降低疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI），減輕體重下降，恢復(fù)結(jié)腸長(zhǎng)度，降低脾臟?/?體重比。HE染色顯示，SP處理組結(jié)腸黏膜上皮完整、隱窩結(jié)構(gòu)正常，黏膜下層無(wú)明顯水腫和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，組織學(xué)評(píng)分顯著低于DSS組；透射電鏡觀察到SP修復(fù)DSS導(dǎo)致的腸上皮細(xì)胞間隙增寬、微絨毛縮短卷曲。腸道屏障功能修復(fù)AB-PAS染色顯示SP緩解DSS誘導(dǎo)的杯狀細(xì)胞減少；免疫熒光證實(shí)SP上調(diào)腸道黏液屏障關(guān)鍵成分MUC-2的表達(dá)；FITC-葡聚糖檢測(cè)表明SP降低腸道通透性，減少外來(lái)物質(zhì)滲漏。Luminex檢測(cè)顯示，SP顯著降低結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ等促炎因子水平，且SP單獨(dú)處理組無(wú)明顯異常癥狀。

DSS撤藥后腸道炎癥消退，SP仍能改善殘留焦慮樣行為，表明其對(duì)腸腦軸的調(diào)控不依賴(lài)腸道炎癥緩解，具有獨(dú)立性。

圖1 SP改善DSS誘導(dǎo)小鼠的結(jié)腸炎癥狀及焦慮樣行為

SP可減輕DSS誘導(dǎo)小鼠的海馬損傷及神經(jīng)炎癥

海馬損傷可影響情緒調(diào)節(jié)中樞的功能，進(jìn)而導(dǎo)致抑郁和焦慮等精神障礙。通過(guò)組織學(xué)染色、細(xì)胞標(biāo)記與細(xì)胞因子檢測(cè)，探究SPSP在減輕神經(jīng)炎癥中的作用。

SP顯著減輕DSS誘導(dǎo)的海馬體神經(jīng)元丟失、核固縮、尼氏小體減少等病理?yè)p傷，維持神經(jīng)元形態(tài)完整。檢測(cè)了海馬組織中炎癥介質(zhì)的濃度，結(jié)果顯示，SP顯著降低了DSS處理小鼠海馬中IL-1β、?TNF?-α、IL-9、?IFN?-γ、IL-13、IL-6、G-CSF、GM-CSF、?MIP?-1β和IL-12P70的水平，但提高了IL-4、IL-5和IL-10的水平，結(jié)果表明，SP通過(guò)調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子與抗炎因子之間的平衡，減輕了DSS誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)炎癥。

為探究SP對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞/星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響，統(tǒng)計(jì)了各組海馬區(qū)這兩種細(xì)胞的數(shù)量。發(fā)現(xiàn)SP減少DSS誘導(dǎo)的Iba-1陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量（抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化），增加GFAP陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量（防止星形膠質(zhì)細(xì)胞丟失）；Western?blot證實(shí)SP降低M1型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物iNOS的表達(dá)，上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP的表達(dá)。合理推斷，SP通過(guò)減輕結(jié)腸炎小鼠海馬區(qū)的病理?yè)p傷和神經(jīng)炎癥，改善了其焦慮樣行為，這可能與抑制小膠質(zhì)細(xì)胞向M1表型極化及防止星形膠質(zhì)細(xì)胞丟失有關(guān)。

圖2 SP減輕DSS誘導(dǎo)小鼠的海馬損傷及神經(jīng)炎癥反應(yīng)

SP改善DSS誘導(dǎo)小鼠腸道菌群失調(diào)并改變微生物組功能

探究SP是否通過(guò)腸道菌群發(fā)揮作用，通過(guò)16S?rRNA測(cè)序分析SP對(duì)DSS誘導(dǎo)菌群失調(diào)的調(diào)控作用，結(jié)合PICRUSt2預(yù)測(cè)菌群代謝功能。

與DSS誘導(dǎo)組相比，SP對(duì)腸道菌群豐富度和多樣性均未產(chǎn)生顯著影響，PCoA分析顯示CON組、DSS組和DSS+SP組之間存在顯著差異，表明細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異。在門(mén)水平，SP?顯著提高厚壁菌門(mén)（Firmicutes）相對(duì)豐度，降低擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）和變形菌門(mén)（Proteobacteria）豐度。在科水平，SP?增加毛螺菌科（Lachnospiraceae）、鼠桿菌科（Muribaculaceae）豐度，降低擬桿菌科（Bacteroidaceae）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）豐度。在屬水平，DSS+SP組中擬桿菌屬（Bacteroides）和擬桿菌亞屬（Alistipes）的相對(duì)豐度降低，而unclassified_Lachnospiraceae、unclassified_Muribaculaceae和?Lachnospiraceae_NK4A136_group的相對(duì)豐度上調(diào)。PICRUSt2預(yù)測(cè)顯示，SP顯著激活肌醇磷酸代謝、膽汁分泌、NOD?樣受體信號(hào)通路等功能模塊，抑制戊糖磷酸途徑、生物膜形成等DSS誘導(dǎo)的異常功能模塊。

圖3 SP可改善DSS誘導(dǎo)小鼠的腸道菌群失調(diào)并改變微生物組功能

SP通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群預(yù)防DSS誘導(dǎo)的腸道損傷及焦慮樣障礙

為驗(yàn)證腸道菌群是否為SP發(fā)揮作用的必需環(huán)節(jié)，進(jìn)行了抗生素耗竭實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。ABX處理14天成功構(gòu)建偽無(wú)菌小鼠模型后，SP對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥狀（DAI、體重、結(jié)腸長(zhǎng)度、腸道結(jié)構(gòu)）和焦慮樣行為的改善作用顯著減弱，表明SP的保護(hù)作用依賴(lài)腸道菌群。

同時(shí)進(jìn)行了糞便微生物移植（FMT）實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，F(xiàn)MT-DSS+SP組表現(xiàn)出更輕的體重下降、更低的DAI、緩解結(jié)腸縮短以及降低的脾臟/體重比，腸道黏膜損傷減輕，杯狀細(xì)胞數(shù)量增加，TNF-α、IL-6等促炎因子水平降低，MPO活性減弱。FMT-DSS+SP組小鼠海馬神經(jīng)元損傷也得到了緩解，促炎因子（TNF-α、IL-1β）mRNA表達(dá)降低，抗炎因子IL-4表達(dá)升高，小膠質(zhì)細(xì)胞M1表型（iNOS、CD80）表達(dá)降低，M2表型（CD206）表達(dá)升高，星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)上調(diào)。此外腸道菌群結(jié)構(gòu)也與FMT-DSS組存在顯著差異，厚壁菌門(mén)、未分類(lèi)鼠桿菌科等有益菌群豐度升高，擬桿菌屬等有害菌群豐度降低。

直接證實(shí)SP的保護(hù)作用依賴(lài)腸道菌群，排除SP直接穿過(guò)血腦屏障發(fā)揮作用的可能，明確菌群是SP調(diào)控腸腦軸的核心“中間人”。

圖4 SP以腸道微生物群依賴(lài)性方式預(yù)防DSS誘導(dǎo)的腸道損傷及焦慮樣障礙

圖5 FMT實(shí)驗(yàn)表明SP通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群減輕了DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎和焦慮樣行為

SP通過(guò)調(diào)控腸道菌群影響海馬基因表達(dá)，涉及NF-κB和GABAergic/Ca2?信號(hào)通路

通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析FMT處理小鼠海馬體的差異表達(dá)基因，結(jié)合WB、免疫熒光染色，明確SP調(diào)控菌群后對(duì)腦內(nèi)信號(hào)通路的影響。

RNA-seq顯示，F(xiàn)MT-DSS與FMT-CON組存在436個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs），F(xiàn)MT-DSS+SP組與FMT-DSS組存在387個(gè)DEGs，其中158個(gè)基因?yàn)楣餐{(diào)控基因。KEGG分析顯示DSS組NF-κB通路激活，而SP通過(guò)菌群抑制其激活。qRT-PCR和Western?blot證實(shí)，SP降低海馬組織中IKBα、p65?的mRNA表達(dá)及p-p65、p-IKBα的蛋白表達(dá)；免疫熒光顯示SP減少小膠質(zhì)細(xì)胞中p-IKBα陽(yáng)性信號(hào)，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB通路激活。KEGG分析顯示SP激活神經(jīng)活性配體-受體相互作用和Ca2?信號(hào)通路。qRT-PCR顯示SP上調(diào)海馬組織中Gabra1、Gabra3、Gabrb2、Camk2d等基因表達(dá)；Western?blot證實(shí)SP增加GABA_A?Rα1、GABA_B?R2、GAD65（GABA?合成關(guān)鍵酶）和CaMKII（鈣濃度傳感器）的蛋白表達(dá)。

免疫熒光顯示SP增強(qiáng)星形膠質(zhì)細(xì)胞中GABA_A?Rα1和CaMKII的陽(yáng)性表達(dá)；流式分選細(xì)胞RNA-seq顯示，SP抑制小膠質(zhì)細(xì)胞中NF-κB通路相關(guān)基因富集，促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞中GABA能突觸和鈣信號(hào)通路相關(guān)基因富集。

圖6 SP通過(guò)調(diào)節(jié)腸道微生物組影響海馬基因的表達(dá)

SP增強(qiáng)腸道微生物源性代謝物肌醇的富集

腸道菌群通過(guò)代謝物介導(dǎo)腸腦軸溝通，采用非靶向代謝組學(xué)分析DSS、DSS+SP、CON三組小鼠的結(jié)腸內(nèi)容物代謝譜，篩選SP調(diào)控的關(guān)鍵代謝物。

PLS-DA分析顯示，三組代謝譜存在顯著分離，DSS+SP組代謝表型更接近CON?組，表明SP可逆轉(zhuǎn)?DSS?誘導(dǎo)的代謝紊亂。共鑒定出395個(gè)差異代謝物，其中肌醇（inositol）是SP干預(yù)后升高最顯著的代謝物之一，且富集于肌醇磷酸代謝、半乳糖代謝等通路。

Spearman相關(guān)性分析顯示，肌醇水平與有益菌群呈正相關(guān)，與結(jié)腸炎嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，提示肌醇可能是菌群介導(dǎo)?SP?保護(hù)作用的關(guān)鍵?“信使分子”。

圖7 SP可增強(qiáng)腸道微生物群源代謝物肌醇的富集

肌醇給藥可改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎及焦慮樣障礙

通過(guò)飲水給予DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠2%肌醇干預(yù)，驗(yàn)證肌醇是否能單獨(dú)模擬SP的雙向保護(hù)作用。

肌醇顯著抑制DSS誘導(dǎo)的體重丟失和DAI升高，恢復(fù)結(jié)腸長(zhǎng)度，修復(fù)腸道上皮損傷，上調(diào)E-cadherin，降低結(jié)腸組織中IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表達(dá)。肌醇處理組在開(kāi)放場(chǎng)試驗(yàn)中移動(dòng)距離、中央?yún)^(qū)域活動(dòng)增加，在高架十字迷宮中開(kāi)放臂停留時(shí)間和進(jìn)入次數(shù)增加，焦慮樣行為緩解。肌醇緩解?DSS?誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元核固縮和尼氏小體丟失，降低海馬組織中促炎因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）mRNA?表達(dá)，升高抗炎因子IL-10表達(dá)；減少I(mǎi)ba-1陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)GABA合成與受體表達(dá)，增加星形膠質(zhì)細(xì)胞及GAT1免疫陽(yáng)性表達(dá)。而單獨(dú)補(bǔ)充肌醇組與對(duì)照組（CON）相比，未觀察到明顯的腸道病理學(xué)和行為學(xué)改變。綜上，這些數(shù)據(jù)表明肌醇可能是SP發(fā)揮有益效應(yīng)的關(guān)鍵候選代謝物。

圖8 腸道代謝物肌醇介導(dǎo)SP對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎及焦慮行為的保護(hù)作用

肌醇在SP對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠焦慮樣行為的作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用

用肌醇合成抑制劑L-690330干預(yù)，驗(yàn)證肌醇是否為SP發(fā)揮作用的必需分子；同時(shí)通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證肌醇對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞的直接調(diào)控作用。

L-690330處理后，SP對(duì)DSS小鼠的抗焦慮作用及海馬體保護(hù)效應(yīng)被顯著逆轉(zhuǎn)。肌醇水平升高：FMT-DSS+SP組小鼠海馬體與血清中肌醇濃度顯著高于FMT-DSS組，證實(shí)菌群衍生的肌醇可進(jìn)入血液循環(huán)并作用于大腦。體外細(xì)胞驗(yàn)證：①?小膠質(zhì)細(xì)胞（BV-2）：100μM肌醇可顯著降低LPS誘導(dǎo)的TNF-α、IL-1β、IL-6?等促炎因子表達(dá)，無(wú)細(xì)胞毒性；②?星形膠質(zhì)細(xì)胞（C8D1A）：肌醇可逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的GABA受體及CaMKII蛋白表達(dá)下調(diào)，激活GABAergic/Ca2?信號(hào)通路。

明確肌醇在SP調(diào)控通路中的“不可替代”地位，同時(shí)證實(shí)肌醇可直接調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞功能，完善“菌群代謝物?–?腦”的調(diào)控鏈條。

圖9 肌醇在SP對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠焦慮樣行為的作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用

研究總結(jié)

SP通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)有益菌群產(chǎn)生肌醇；肌醇進(jìn)入循環(huán)后作用于海馬體，一方面抑制小膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB促炎通路，減輕神經(jīng)炎癥；另一方面激活星形膠質(zhì)細(xì)胞GABAergic/Ca2?信號(hào)通路，增強(qiáng)抗焦慮神經(jīng)傳導(dǎo)；最終實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)腸炎的腸道保護(hù)與焦慮樣行為的神經(jīng)調(diào)節(jié)，形成“SP-腸道菌群-肌醇-海馬體”的完整調(diào)控軸。