1、前言

1.1適用范圍

本指南介紹百邁客動(dòng)物類組織&核酸樣品的送樣要求及制備方法。采集送樣前請?jiān)敿?xì)閱讀。信息單中樣本名稱、組織部位必須與實(shí)物相符，避免因信息單與實(shí)物不符導(dǎo)致反復(fù)核對(duì)，影響樣本質(zhì)量、錄入周期，導(dǎo)致提取核酸質(zhì)量不滿足建庫測序要求，實(shí)驗(yàn)周期過長等

1.2提取風(fēng)險(xiǎn)提示

核酸提取質(zhì)量與物種及組織部位、樣本制備、樣本交接、提取方法與操作、以及環(huán)境等因素息息相關(guān)，尤其是三代超長提取對(duì)樣的要求更高。組織提取時(shí)可能受到上下游處理操作的影響，因此較難保證單次提取滿足質(zhì)量要求，望老師知悉理解，并做好組織備份。為保障獲得相對(duì)較高質(zhì)量的核酸，請老師務(wù)必按照以下指導(dǎo)原則準(zhǔn)備樣本。對(duì)于珍貴樣本或微量樣本，建議自行提取

2、組織送樣量要求

注意：未在表格出現(xiàn)的物種，請單獨(dú)溝通。送樣量結(jié)果展示為滿足提取一次的量，如樣品經(jīng)過特殊處理或樣本狀態(tài)異常有幾率影響得率，為了保證您的實(shí)驗(yàn)可以順利進(jìn)行，請酌情增加送樣量

2.1常規(guī)植物組織送樣要求

3、核酸送樣要求

1)核酸送樣需要提供相關(guān)檢測結(jié)果，DNA類核酸可提供以下檢測手段中的一種或多種檢測結(jié)果： Qubit、 NanoDrop、 AGE，同時(shí)請采取適當(dāng)?shù)募兓椒?，以避免多糖、多酚、蛋白或者核酸酶?duì)DNA樣品的污染，并詳細(xì)注明溶解DNA所使用的溶解液類型

2)如果您開展的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目為miRNA的相關(guān)實(shí)驗(yàn)，并且提供的是總RNA的樣本，請務(wù)必確認(rèn)您采用的總RNA的提取方法保留了小RNA （ 包括miRNA），提取試劑盒型號(hào)備注送樣信息單中

3.1二代DNA送樣量要求

3.2三代DNA送樣量要求

3.3RNA類送樣量要求

1)針對(duì)核酸有雜質(zhì)、污染、粘稠、顏色等情況，需要過柱純化后送樣或者酌情增加送樣量

2)核酸樣品建議使用1.5ml、2ml EP管裝載樣品，其他保存管容易破裂且不利于保存樣品和后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開展

3)為了防止樣品污染和混淆，禁止使用96孔板和深孔板裝載樣品

4)用乙醇沉淀的樣品由于運(yùn)輸中會(huì)有少量乙醇揮發(fā)，建議將樣品管蓋用封口膜纏繞4-5圈

5)考慮到核酸可能存在含有雜質(zhì)、顏色等物質(zhì)導(dǎo)致會(huì)產(chǎn)生大量損失的風(fēng)險(xiǎn)，為保證樣本一次檢測合格并節(jié)約寶貴的重送樣時(shí)間，送樣建議量是高于公司判定標(biāo)準(zhǔn)的，請?jiān)诤怂崃孔銐虻那疤嵯卤M量按照送樣建議來送樣

4、樣品制備保存指南

4.1常規(guī)植物類樣本（不含藻類）制備流程

由于老葉或其它組織DNA&RNA含量可能較低，而次生代謝物含量一般相對(duì)較高，因此，為降低DNA&RNA提取難度并減少污染物干擾，請盡量選擇健康、幼嫩的葉片組織；不建議選擇易帶有寄生或共生生物的組織，以及不易清洗和研磨的根、莖等組織致密的器官。另外藻類組織中的水分會(huì)影響提取得率，取樣時(shí)需將組織樣中的水分吸干。建議在采集樣本之前，將樣本置于黑暗環(huán)境24-48小時(shí)后再制備樣本（停止光合作用，減少代謝干擾），新鮮組織樣采樣流程如下：

1)用清水將材料表面的灰塵及泥土沖洗干凈，吸干，再從植物體上取下新鮮組織（注：如果是需要進(jìn)行處理，請?jiān)诨铙w上進(jìn)行處理后再取樣

2)如果組織體積較大，將組織剪切成 50-100 mg小塊,約黃豆大小的小塊,放入提前準(zhǔn)備好的凍存管中

3)處理好的組織樣本混合均勻后立即保存于提前標(biāo)記編號(hào)、液氮預(yù)冷的2 mL 或更大體積的旋蓋凍存管中，根據(jù)組織樣本量選擇核酸凍存管

4)液氮凍存前將樣品分割成 50~100 mg 左右的小塊，處理好的組織樣本混合均勻后保存于提前標(biāo)記編號(hào)、液氮預(yù)冷的2 mL 或更大體積的旋蓋凍存管中，根據(jù)組織樣本量選擇核酸凍存管

5)迅速置于液氮中冷凍 1~2 h，然后按照順序依次放入樣品盒中（不建議自封袋送樣），轉(zhuǎn)移至-80 °C長期保存（禁止亂放，尤其是項(xiàng)目中樣品個(gè)數(shù)較多時(shí)），干冰運(yùn)輸

注：植物組織不建議使用組織保護(hù)液保存。對(duì)于一些需要?jiǎng)內(nèi)シN皮處理的，因樣品速凍后無法準(zhǔn)確剔除，如有需要?jiǎng)內(nèi)シN皮的老師須自行操作

4.2Ultra Long ONT類植物樣本

4.2.1植物組織選取及取樣步驟

1)準(zhǔn)備剪刀、鑷子、錫箔紙，選取新鮮幼嫩的組織， 例如幼嫩的葉片（也可以是新長出的幼嫩根尖）

2)除去枯萎的，損傷的部分，除去莖，葉柄和粗的葉脈

3)將組織清理干凈，可放在容器中用水沖洗，除去雜質(zhì)和其他殘余碎片

4)將清洗干凈的樣本倒在吸水紙上，再蓋上一張吸水紙用手輕輕壓幾次（注意不要太用力損傷 葉片），水盡可能除去

5)將葉片稱量一下，每0.5g/管（推薦使用 50ml 離心管）裝好，標(biāo)注樣本名稱，日期，準(zhǔn)確重量

6)放入液氮快速冷凍 10min，轉(zhuǎn)入-80 °C 冰箱保存，干冰運(yùn)輸

7)葉片剪下后的稱量等操作，請?jiān)?10min 內(nèi)完成，時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致葉片失水不可用，部分地區(qū)氣溫較高失水更快，操作時(shí)間需更短

4.2.2注意事項(xiàng)與說明

1)葉片要幼嫩的、新鮮的 、完整的（不要有損傷），可用手對(duì)比老葉和嫩葉的觸感，嫩葉的觸感非常柔軟

2)林木 、灌木類的請根據(jù)生長周期來確定采樣時(shí)間， 最好是發(fā)芽后長出來的嫩葉

3)禾本科黃化苗 1-2 周，最好有專門的黃化經(jīng)驗(yàn)，黃化太過會(huì)造成細(xì)胞核難提取 。如果不會(huì)黃化就送 1-2 周剛長出來的葉片，具體生長時(shí)間需根據(jù)植物的生長狀態(tài)判斷

4)組培苗，不建議直接使用，盡量移植到土壤中培育出植株，取新長出的幼嫩葉片，若使用組培苗送樣，請客戶多準(zhǔn)備備份樣本

5)送樣前請拍照記錄樣品狀態(tài)

5、注意事項(xiàng)

核酸提取質(zhì)量與物種及組織部位、采集方法及保存狀態(tài)、提取方法及操作、實(shí)驗(yàn)器材及環(huán)境等因素均有密不可分的聯(lián)系，尤其是三代超長提取對(duì)樣本的質(zhì)量、總量要求更高，望知悉及理解，并做好樣本備份。為了保障獲得高質(zhì)量的核酸，請務(wù)必按照送樣手冊所規(guī)定的準(zhǔn)備樣本。對(duì)珍貴樣本或者微量樣本，建議自行提取

1)組織速凍時(shí)間：組織離體后，胞內(nèi)核酸便開始降解，尤其是 RNA，故采集時(shí)，目的組織離體后，需立即速凍，建議 3min 內(nèi)完成，越快越好。速凍時(shí)間過短會(huì)導(dǎo)致速凍不徹底，核酸有降解風(fēng)險(xiǎn)

2)組織送樣量：建議送樣量適用于 95%的物種組織，少部分組織因胞內(nèi)核酸量較低，需適當(dāng)增加送樣量，比如動(dòng)物皮膚、毛發(fā)等。請嚴(yán)格按照上方組織送樣量要求送樣，送樣量過少或過多均不利于提取實(shí)驗(yàn)。采樣量較少會(huì)導(dǎo)致提取的核酸總量、濃度不合格，采樣量過多反而會(huì)造成速凍不徹底、提取取樣困難、凍融降解等危險(xiǎn)

3)組織狀態(tài)：不建議送組織狀態(tài)差或非生長旺盛期樣品，核酸有一定幾率降解

4)組織保存管的選擇：所有組織樣品務(wù)必使用離心管或螺紋管保存，切勿直接裝入密封袋（低溫凍脆易破裂，導(dǎo)致樣品泄露，交叉污染）保存

5)組織樣品保存方法選擇：首選液氮速凍；沒有液氮條件的，可直接放入-80℃冰箱凍存。未使用液氮速凍或液氮速凍時(shí)間過短都有一定幾率導(dǎo)致核酸降解

6)組織送樣方式的選擇：干冰運(yùn)輸，且需要保證干冰的充足，冰袋和常溫送樣，有幾率導(dǎo)致核酸的降解。除RNA類樣品可使用RNAlater保存送樣，其余產(chǎn)品均建議送速凍組織，不建議使用保護(hù)液送樣，化開離心會(huì)有幾率導(dǎo)致核酸降解；不建議酒精送樣，固定不徹底，有一定幾率殘留核酸酶，降解核酸

7)凍融組織： 組織凍存后，一旦凍融，核酸降解概率大于 80%，幾乎不可能提取成功，此類組織不建議送樣。請各位老師送樣前注意組織保存狀態(tài)， 確保組織未發(fā)生過凍融情況

8)帶血組織：由于血液沒有專業(yè)的保護(hù)劑，去除不凈一起速凍送樣會(huì)影響組織的完整性

9)長年保存的組織：保存時(shí)間超過一年的組織不建議送樣

10)組織分離要求：正常組織樣本中不能含有病變組織，而病變組織樣本中也不可以夾帶有正常組織，提取實(shí)驗(yàn)時(shí)無法精確取樣，無法稱重。組織量過多的不能全部取樣，只隨機(jī)選取適量組織提取

11)對(duì)于同一個(gè)組織樣品需要同時(shí)提取 DNA和 RNA 的，請務(wù)必分成兩管分批次送樣。樣本的特殊處理包括：鹽處理、溫度處理、藥物處理、病毒侵染、傷害處理、干旱處理等脅迫處理方式，不同程度的處理對(duì)樣本的核酸質(zhì)量會(huì)造成不同程度的影響，常見的會(huì)導(dǎo)致核酸 的降解或者得率降低。因此，經(jīng)過特殊處理的樣本，在送樣時(shí)，務(wù)必請?jiān)跇颖拘畔沃羞M(jìn)行詳細(xì)的備注，以便盡量提高提取的成功率和避免樣本的浪費(fèi)

6、不合格樣品存在風(fēng)險(xiǎn)

6.1樣本總量不足、濃度過低存在風(fēng)險(xiǎn)

1)文庫構(gòu)建失敗

2)文庫產(chǎn)量低不能上機(jī)測序或測序數(shù)據(jù)量不足

3)導(dǎo)致數(shù)據(jù)隨機(jī)性異常

4)數(shù)據(jù)質(zhì)量差

6.2降解樣本風(fēng)險(xiǎn)

1)文庫構(gòu)建失敗

2)文庫產(chǎn)量低不能上機(jī)測序或測序數(shù)據(jù)量不足

3)導(dǎo)致數(shù)據(jù)隨機(jī)性異常

4)數(shù)據(jù)質(zhì)量差

5)導(dǎo)致數(shù)據(jù)duplication比例高、隨機(jī)性差

6)導(dǎo)致Small RNA rRNA比例高，影響有效數(shù)據(jù)，文庫片段異常

6.3蛋白或其他雜質(zhì)污染

1)可能影響Small RNA電泳分離，造成切膠不準(zhǔn)，影響問題質(zhì)量

2)可能影響RNA-seq磁珠分離導(dǎo)致建庫失敗，或即使達(dá)到上機(jī)要求也可能導(dǎo)致文庫隨機(jī)性差等問題

3)文庫構(gòu)建失敗

4)文庫產(chǎn)量低不能上機(jī)測序或測序數(shù)據(jù)量不足

6.4目標(biāo)RNA含量低

1)總RNA達(dá)到要求，但由于樣本特異性，small RNA含量低于正常樣本，導(dǎo)致建庫失敗

2)總RNA達(dá)到要求，但由于處理或組織部位的特異性，mRNA降解或含量低，導(dǎo)致建庫失敗或者測序數(shù)據(jù)中rRNA 數(shù)據(jù)比例高