Bulked Segregant Analysis（BSA）分析是利用極端性狀個體混池快速進行功能基因挖掘的常用方法，廣泛應用在植物基因克隆方面。SLAF-seq是百邁客自主研發(fā)的簡化基因組測序技術(shù)，通過對基因組特定的酶切片段進行高通量測序，在降低基因組復雜度的基礎上，又獲得大量的基因組變異信息，在群體遺傳研究中發(fā)揮著重要作用。將SLAF-seq和BSA分析完美結(jié)合（SLAF-BSA）進行功能基因定位，是一種快速、準確、性價比極高的分析策略。日前，由百邁客和揚州大學陳學好教授課題組合作，利用SLAF-BSA策略定位黃瓜耐淹基因，相關(guān)研究成果發(fā)表于新一期的Plant Journal雜志。本期圖譜君將對這一成果解讀，同時文末繼續(xù)有基于遺傳群體進行基因定位的國自然標書，期待能給大家3月份的國自然基金申請帶來一些靈感。
英文標題：The major-effect QTL CsARN6.1 encodes an AAA-ATPase domain-containing protein that is associated with waterlogging stress tolerance through promoting adventitious root formation
中文標題：CsARN6.1編碼的AAA-ATPase基因通過促進不定根形成增強黃瓜耐水淹性
發(fā)表期刊：the Plant Journal， 2018
影響因子：5.90
背景
高等植物需要一定量的氧氣來保持代謝和生長，然而在水淹狀態(tài)下，土壤中氧含量比正常情況下低320,000倍，植物根系可利用氧氣含量降低，進而影響植物根系的很多生長和代謝生理過程。水淹情況下，大量有害物質(zhì)積累也會造成對植物的毒害作用。以上變化將嚴重影響植物生長、干物質(zhì)積累以及植物最終的產(chǎn)量。所以，分離植物耐水淹基因、揭示耐水淹分子機制、開展耐水淹品種選育具有重要意義。
黃瓜是重要的蔬菜品種，其根生長淺，對氧氣需求較為嚴格，這造成它對水淹脅迫非常敏感。在水淹脅迫下，黃瓜下胚軸通過產(chǎn)生不定根來獲取氧氣，以適應水淹脅迫。為解析水淹脅迫下黃瓜不定根生產(chǎn)現(xiàn)象的遺傳學機制，研究者曾利用耐水淹材料Zaoer-N 和不耐水淹材料Pepino構(gòu)建的群體進行QTL定位，已經(jīng)分離了一個控制不定根數(shù)目的主效QTL ARN6.1，該QTL在多年的實驗均解釋了較高的表型貢獻率。本研究將對該QTL進行精細定位，確定引起性狀差異的基因，并進行多方面的驗證。
材料方法
主要結(jié)果
1.不定根數(shù)目是數(shù)量性狀且與水淹脅迫耐受力顯著相關(guān)
表型觀察發(fā)現(xiàn)，水淹處理7天后，Zaoer-N幼苗下胚軸生長出許多不定根，而Pepino幾乎沒有（圖1）；通過對F2群體表型統(tǒng)計，所有子代的不定根數(shù)目表現(xiàn)出正態(tài)分布，這也說明了該性狀為數(shù)量性狀（圖2）。另外，對F2群體的949個個體進行水淹耐受力評估打分，發(fā)現(xiàn)不定根數(shù)目與水淹耐受力之間呈顯著正相關(guān)，皮爾森相關(guān)系數(shù)為0.72（P = 0.05），這表明不定根數(shù)目可以作為衡量水淹耐受力的可靠指標。
圖1 Zaoer-N和Pepino不定根生長情況
圖2 F2群體不定根數(shù)目分布統(tǒng)計
2、ARN6.1的初定位
利用SLAF-seq的方法對親本及兩個極端混池進行測序，親本測序深度分別為29.18×和22.85×，兩個混池的深度分別為50.6×和53.72×，以9930為參考基因組，利用△SNP-index和ED的方法計算顯著關(guān)聯(lián)位點，將關(guān)聯(lián)區(qū)域定位在6號染色體標記SLAF_marker_192310和SLAF_marker_192096之間，區(qū)間大小301kb（圖3）。
圖3 BSA定位結(jié)果
3、ARN6.1的精細定位
利用定位區(qū)間側(cè)翼SLAF標記（SLAF_marker_192310和SLAF_marker_192096）上的SNP，分別各開發(fā)KASP標記（KASP1和KASP13），并對2274個F2子代進行分型，獲得33個重組個體；再在KASP1和KASP13之間開發(fā)11個KASP標記，對33個重組個體進行基因分型，共得到8種單倍型。結(jié)合重組個體基因分型和表型數(shù)據(jù)，將ARN6.1定位到61.5kb的區(qū)間（KASP10和KASP11）（圖4a）。為進一步縮小區(qū)間，利用KASP10和KASP11對4417個F2個體進行分型，得到6個重組個體，這6個重組個體分別自交得到6個F2:3家系，然后利用新開發(fā)的5個dCAPS對F2:3家系進行分型，結(jié)合所有表型數(shù)據(jù)，最終將ARN6.1定位在36.1kb的范圍內(nèi)（圖4b）。對該區(qū)進行注釋，共有7個基因（圖4c），有趣的是，其中5個基因都被預測為編碼AAA 型的ATP酶家族蛋白。
圖4? ARN6.1精細定位過程
2個親本重測序分析，在36.1kb的區(qū)間內(nèi)開發(fā)到25個SNP，為確定哪個SNP與性狀真實相關(guān)，研究者對100個黃瓜自交系的23個SNP（2個SNP只存在于Zaoer-N中而被過濾掉）進行分型，結(jié)合每個自交系不定根數(shù)目的表型數(shù)據(jù)進行局部關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示SNP02與表型有較強的關(guān)聯(lián)性。對SNP02分析發(fā)現(xiàn)，其位于Csa6G504460的第二外顯子，可能就是引起變異的SNP位點（圖5a）。
圖5 Csa6G504460的分離及表達量分析
4、表達分析驗證Csa6G504460
前期研究中，研究者對親本Zaoer-N和Pepino幼苗下胚軸在水淹處理后進行轉(zhuǎn)錄組分析，以上定位區(qū)間內(nèi)的7個基因只有Csa6G504460在處理組和對照組間存在差異表達，并且差異表達只發(fā)生在Zaoer-N中（圖5b）。而后，研究者對這7個基因又進行qRT-PCR分析，同樣發(fā)現(xiàn)只有Csa6G504460在Zaoer-N的處理組和對照組間存在差異表達，并且在處理后36h表達量差異出現(xiàn)峰值（圖5c）。另外，組織特異表達分析表明Csa6G504460在多個組織中均有表達，但是在根中的表達量顯著高于其他組織。因此，從基因表達角度驗證了Csa6G504460（以下命名為CsARN6.1）的真實性。
5、CsARN6.1突變體降低ATP酶活性
基因組和cDNA序列分析顯示，CsARN6.1擁有2個外顯子，被預測為編碼含有511個氨基酸殘基的AAA-ATPase結(jié)構(gòu)域蛋白，該蛋白中含有一個coiled-coil結(jié)構(gòu)域（圖6），前期關(guān)聯(lián)到的SNP02即位于該結(jié)構(gòu)域，由于該SNP的突變導致Asp被替換成Gly，Zaoer-N為CsARN6.1^Asp型，表現(xiàn)出較強的ATP酶活性，而Pepino為CsARN6.1^Gly型，幾乎沒有ATP活性（圖7）。
圖6 AAA-ATPase基因結(jié)構(gòu)?
圖7 CsARN6.1^Asp和CsARN6.1^Gly蛋白活性比較
6、轉(zhuǎn)基因驗證
為驗證CsARN6.1的功能，將CsARN6.1^Asp轉(zhuǎn)入擬南芥中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的根長顯著長于對照，同時，轉(zhuǎn)基因植株上可以明顯觀察到側(cè)根發(fā)育，而對照組則沒有側(cè)根發(fā)育（圖8）。為進一步驗證，研究者將CsARN6.1^Asp轉(zhuǎn)入黃瓜品種Xintaimici（CsARN6.1^Gly型），并經(jīng)多代自交和篩選，獲得單拷貝的純合轉(zhuǎn)基因植株。發(fā)芽后3天，轉(zhuǎn)基因植株的初生根長度顯著長于野生型。水淹處理后，轉(zhuǎn)基因黃瓜下胚軸中CsARN6.1的表達量顯著高于野生型。處理后7天，轉(zhuǎn)基因黃瓜下胚軸的不定根數(shù)目明顯高于野生型（圖9 e.f.g.h）。另外，野生型黃瓜葉片和子葉的萎黃病較轉(zhuǎn)基因黃瓜嚴重。以上轉(zhuǎn)基因結(jié)果證實CsARN6.1能夠促進不定根形成和黃瓜水淹耐受力（圖9 i.j）。
圖8 轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型表型比較?
圖9 轉(zhuǎn)基因黃瓜與野生型表型比較?
7、ATP酶活性影響黃瓜不定根形成
前期研究發(fā)現(xiàn)，EDTA能夠抑制AAA-ATPase蛋白的ATP酶活性。研究者通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)EDTA處理的CsARN6.1^Asp蛋白的ATP酶活性相對于對照降低24%（圖10 a）。隨后，研究者用加入EDTA的水處Zaoer-N幼苗，以檢測ATP酶活性損耗對下胚軸不定根的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)EDTA處理后，Zaoer-N沒有了不定根生成能力（圖10 b.c）。
進化樹分析顯示，CsARN6.1與擬南芥At2G18190和At3G50930存在較高的同源性（圖10d），而在之前研究中發(fā)現(xiàn)，H2O2處理擬南芥后，At2G18190.1和At3G50930.1被顯著誘導表達。水淹后植物體內(nèi)H2O2積累是普遍的生理響應。因而研究者嘗試在水中加入H2O2后處理Zaoer-N幼苗，與無水處理的對照相比，48h后處理組植株CsARN6.1的表達量是對照組的4.3倍，與不加H2O2的水處理的對照相比，48h后CsARN6.1的表達量是對照組的2.1倍（圖10 e）。5天后統(tǒng)計不同處理的材料下胚軸不定根數(shù)目，發(fā)現(xiàn)與不加H2O2的水處理的對照相比，水中加入H2O2的處理組的不定根數(shù)目增加60%（圖10 f.g）。
圖10 EDTA及H2O2處理對ATP酶和黃瓜生根的影響
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