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標(biāo)題：Integrated single-cell transcriptomic analyses reveal that GPNMB-high macrophages promote PN-MES transition and impede T cell activation in GBM

發(fā)表雜志：EBioMedicine（IF=11.205）

發(fā)表時間：202209

研究背景

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）是具有侵襲性的原發(fā)性腦腫瘤類型，通常對目前的治療具有耐藥性，以腫瘤微環(huán)境為中心的療法可能為GBM治療帶來新的希望。因此，迫切需要深入了解腫瘤-基質(zhì)通訊，以確定有希望的治療靶點(diǎn)。

研究方案設(shè)計

1、收集人、小鼠GBM的單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)、RNA-seq數(shù)據(jù)和空間轉(zhuǎn)錄組（Spatial transcriptomics，ST）數(shù)據(jù)；

2、免疫細(xì)胞分選

1）小鼠脾臟T cells：EasySep Mouse T Cell Isolation Kit (Stemcell Technologies; 19851) ；

2）單核細(xì)胞：RPMI-1640 medium (Life Technologies, 11875119)沖洗股骨和脛骨，40μm濾器過濾，EasySep Mouse Monocytes Isolation Kit (Stemcell Technologies; 19861)分選.；

3）CD11b+F4/80+GPNMB+ macrophages and CD11c+MHCII+ dendritic cells：anti-CD45 (1:200, eBioscience), anti-CD11b (1:200, eBioscience), anti-CD11c(1:200, BioLegend), anti-F4/80 (1:200, BioLegend), anti-MHCII (1:200, eBioscience) and anti-GPNMB (1:100, Invitrogen)。

3、流式分選：小鼠GBM細(xì)胞懸液抗體孵育30 mins，anti-CD45 (1:200, eBioscience)、anti-CD3 (1:100, BioLegend)、anti-CD11b (1:200, BioLegend)、anti-CD11c (1:200, BioLegend)、anti-F4/80 (1:200, BioLegend)、anti-MHCII (1:200, eBioscience) 、IgG antibodies對照；

4、免疫熒光：anti-GPNMB (1:50, R&D Systems)、anti-Mac-3 (1:100, BD)、anti-CD3(1:100, Abcam) 。

5、細(xì)胞共培養(yǎng)：前神經(jīng)元型膠質(zhì)瘤細(xì)胞和新鮮分離的CD11b+ F4/80+巨噬細(xì)胞，每三天加入新鮮的巨噬細(xì)胞，持續(xù)的刺激后檢測間充質(zhì)表型的三種主要轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)（EPAS1、CEBPB、FOSL2）。

數(shù)據(jù)分析方法

1、scRNA-seq數(shù)據(jù)處理：Seurat，低質(zhì)量細(xì)胞過濾（a cutoff value of less than 200 total feature RNA and more than 5% mitochondrial RNA）、SCTransform標(biāo)準(zhǔn)化、PCA降維（npcs=30）、細(xì)胞類群識別FindNeighbors and FindClusters（resolution=0.8）、差異分析FindAllMarkers function (cutoff:min.pct=0.25 and logfc.threshold=0.25)；

2、ST數(shù)據(jù)處理：Seurat 4.0，SCTransform標(biāo)準(zhǔn)化、 PCA and UMAP降維聚類（npcs=30）、SpatialFeaturePlot空間可視化；

3、腫瘤拷貝數(shù)據(jù)變異：inferCNV，過濾expressed less than 10 cells and a median expression below 0.1；

4、細(xì)胞軌跡分析：Monocle 2，過濾expression was less than 0.5 and expressed cells were fewer than 200；

5、轉(zhuǎn)錄因子活性：SCIENCE，相關(guān)性GENIE3 (treeMethod= ”RF”, K=”sqrt”, nTrees?=?1000)

6、細(xì)胞通訊：Nichenet（Only the top 15% expressed genes in sender cells were calculated by regulatory potentials and ligand activity was ranked with a cutoff of 0.5 using Pearson test）、CytoTalk（分析T cells、 dendritic cells、Gpnmb-high macrophages、monocytes）

研究思路

研究結(jié)果

1、scRNA-seq分析GBM腫瘤異質(zhì)性圖譜

利用Seurat整合分析了來自不同數(shù)據(jù)集的scRNA-seq數(shù)據(jù)（GSE103224、GSE138794、GSE139448和GSE131928），共獲得來自40例患者的54,534個細(xì)胞（圖1a）；利用inferCNV分析進(jìn)一步鑒別腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞（圖1），與已發(fā)表的WES 數(shù)據(jù)一致；鑒定注釋到的惡性細(xì)胞包括：MES-like細(xì)胞（12.2%，CHI3L1、ADM）、AC-like細(xì)胞（36%，MLC1、HOPX）、NPC-like細(xì)胞（4.9%，CD24、DCX）和OPC-like細(xì)胞（26.4%，PDGFRA、OLIG1），非腫瘤細(xì)胞包括：巨噬細(xì)胞（8.2%，CD163、CD68）、小膠質(zhì)細(xì)胞（1.5%，CX3CR1、TMEM119）、淋巴細(xì)胞（0.7%，CD3D、NKG7）、內(nèi)皮細(xì)胞（1.1%，VWF、PECAM1）、腫瘤相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞（0.8%，COL1A2、BGN）、少突膠質(zhì)細(xì)胞（4.3%，PTGDS、MBP）（圖1c-d）；GBM患者表現(xiàn)出高水平的瘤內(nèi)異質(zhì)性，尤其是腫瘤細(xì)胞（圖1E-F）；GSEA分析也驗(yàn)證了GBM的不同腫瘤細(xì)胞亞型（圖1g）。

2、軌跡分析揭示前神經(jīng)元-間充質(zhì)亞型轉(zhuǎn)換中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子

利用細(xì)胞軌跡分析，探索GBM不同腫瘤亞型間的分化關(guān)系，結(jié)果顯示擬時間線上主要由NPC-和OPC-like 腫瘤細(xì)胞逐漸分化為AC-和MES-like腫瘤細(xì)胞，同時有個小分支為AC-like腫瘤細(xì)胞，揭示了GBM的可塑性和前神經(jīng)元型（proneural, PN）到間質(zhì)型（mesenchymal, MES）的動態(tài)過渡（圖2a-c）；PN與細(xì)胞周期、G2M檢查點(diǎn)和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化相關(guān)的通路顯著富集，表明PN具有高度增殖性和可塑性，而MES與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、缺氧、ECM組織和細(xì)胞粘附相關(guān)的通路顯著富集（圖2d）；利用TCGA數(shù)據(jù)集進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示，與PN組相比，具有MES-like轉(zhuǎn)錄組特征的患者總生存期較差，而與MES-low組相比，MES-high組預(yù)后更差，表明具有間充質(zhì)特征的GBM患者的生存結(jié)局較差（圖2e）。Tips：利用TCGA數(shù)據(jù)庫中的臨床數(shù)據(jù)，將單細(xì)胞數(shù)據(jù)中鑒定到關(guān)鍵maker基因或基因集進(jìn)行生存分析，是探討臨床意義的有效途徑。

利用SCENIC分析PN或MES細(xì)胞中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)錄因子E2F1、SOX9、RARA、SOX11和SOX4在OPC和NPC細(xì)胞中差異過表達(dá)，而 EAPS1、CEBPB、FOSL2、STAT2和EGR1在MES和AC細(xì)胞狀態(tài)中差異過表達(dá)，細(xì)胞軌跡分析證實(shí)了PN-MES轉(zhuǎn)換過程中EPAS1、CEBPB和FOSL2的激活以及SOX4、SOX11的下調(diào)（圖2k）。以上結(jié)果突出了從PN到MES細(xì)胞狀態(tài)的動態(tài)轉(zhuǎn)變主要是由關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子驅(qū)動的。

3、PN-和MES-GBM的腫瘤免疫微環(huán)境解析

利用MES基因特征將患者分為MES-high和MES-low組，發(fā)現(xiàn)MES-high組腫瘤微環(huán)境中伴有豐富的巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞浸潤（圖3a, b）；但T細(xì)胞浸潤在很多癌種的研究中與患者預(yù)后呈正相關(guān)，因此利用TCGA數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析，GBM MES亞型表達(dá)更高的T細(xì)胞和髓系細(xì)胞標(biāo)志物，并且T細(xì)胞與巨噬細(xì)胞存在很強(qiáng)的相關(guān)性（圖3c-d）；對空間scRNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)CD8 + T細(xì)胞與CD68 +髓系細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞共定位（圖3e），證實(shí)了T細(xì)胞與髓系細(xì)胞之間存在空間上的緊密接觸，可能發(fā)生在血管微環(huán)境中（vascular niches）。Tips：每個實(shí)驗(yàn)組增加ST樣本，不僅能與單細(xì)胞數(shù)據(jù)互相驗(yàn)證，還能對maker基因和細(xì)胞類型進(jìn)行空間定位，精準(zhǔn)鎖定有真實(shí)空間物理接觸的細(xì)胞間互作關(guān)系。

利用反卷積算法對TCGA數(shù)據(jù)進(jìn)一步進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞豐度與巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞顯著相關(guān)，這是兩個主要的髓系細(xì)胞（圖3f）；利用流式細(xì)胞術(shù)，分析小鼠GBM中的免疫細(xì)胞，證實(shí)了T細(xì)胞與CD11b + F480 +腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）或CD11c + MHCII + DC顯著正相關(guān)（圖3g）。因此，間充質(zhì)亞型中T細(xì)胞比例較高主要是由于巨噬細(xì)胞的浸潤。

4、源自巨噬細(xì)胞的GPNMB有助于PN-MES細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變

利用NicheNet分析腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞間信號通訊，鑒定到了多個基質(zhì)細(xì)胞-腫瘤細(xì)胞相互調(diào)控的配體-受體對，其中預(yù)測到巨噬細(xì)胞高表達(dá)的GPNMB與大多數(shù)間充質(zhì)靶標(biāo)存在相互作用（圖4a），GPNMB是一種跨膜糖蛋白，最初是在腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，參與腫瘤遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移，通過直接抑制T細(xì)胞活化來逃避免疫；Tips：基于個性化分析結(jié)果，優(yōu)先篩選TOP基因（顯著性、差異倍數(shù)、靶標(biāo)基因數(shù)目等），結(jié)合研究領(lǐng)域內(nèi)已有特定功能報道的基因或通路，可以幫助更快鎖定目標(biāo)分子。

HPA和TCGA數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，GPNMB主要在巨噬細(xì)胞中表達(dá)，并且與巨噬細(xì)胞標(biāo)志物顯著正相關(guān)，這表明巨噬細(xì)胞是GPNMB的主要來源（圖4b, c），流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果證實(shí)了GPNMB主要在巨噬細(xì)胞上表達(dá)，而不是樹突狀或腫瘤細(xì)胞。Tips：流式細(xì)胞術(shù)是單細(xì)胞測序常見的下游驗(yàn)證方法，可用來分選目標(biāo)細(xì)胞類群、驗(yàn)證細(xì)胞比例的變化和新鑒定的maker基因作為特定細(xì)胞分選的可行性等。

GPNMB在MES亞型患者中高表達(dá)，并且與低級別和高級別膠質(zhì)瘤的預(yù)后不良相關(guān)（圖4d, e）；推測高表達(dá)GPNMB的巨噬細(xì)胞可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞向MES表型轉(zhuǎn)變，進(jìn)一步利用細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)來驗(yàn)證這一假設(shè)，結(jié)果表明，長期接觸巨噬細(xì)胞可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中間充質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，并且靶向GPNMB的中和抗體治療可以部分消除這種作用，表明GPNMB是PN-MES狀態(tài)過渡的重要調(diào)節(jié)因子（圖4f）。

5、小鼠scRNA-seq分析單核細(xì)胞分化為Gpnmb-high巨噬細(xì)胞

收集小鼠GBM scRNA-seq數(shù)據(jù)，重點(diǎn)關(guān)注在早期（d7）和晚期（d28）GBM小鼠的CD45 +免疫細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞maker基因表達(dá)鑒定到了NK cells、Cd8+ T cells、Cd4+ T cells、 B cells、neutrophils、cDC1、cDC2、pDC、mDC、monocytes、TAM、monocytes/TAM、microglia cells（圖5a）；與以往的報道類似，巨噬細(xì)胞隨著腫瘤進(jìn)展急劇侵入腫瘤部位，而小膠質(zhì)細(xì)胞在腫瘤發(fā)展過程中逐漸消失（圖5b）；細(xì)胞軌跡分析推斷出樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞起源于單核細(xì)胞，并隨著腫瘤進(jìn)展而逐漸分化（圖5c）；不同的通路主導(dǎo)了腫瘤浸潤T細(xì)胞的募集，單核細(xì)胞主要表達(dá)Cxcl10、Cxcl9、樹突狀細(xì)胞特異性表達(dá)Ccl17、Ccl22，而巨噬細(xì)胞表達(dá)Ccl24，Saa3、Arg1和Gpnmb僅在巨噬細(xì)胞中出現(xiàn)(圖5d）；在腫瘤發(fā)生過程中，Arg1和Gpnmb的表達(dá)在巨噬細(xì)胞中被強(qiáng)烈誘導(dǎo)（圖5e-g），這與人GBM數(shù)據(jù)集中的發(fā)現(xiàn)一致；然而，Gpnmb敲低后CD206（經(jīng)典M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物）表達(dá)不變，提示GPNMB不是M2巨噬細(xì)胞極化的驅(qū)動因素；免疫熒光染色顯示GPNMB+巨噬細(xì)胞與T細(xì)胞共定位（圖5h），表明它們之間存在潛在的相互作用。

6、GPNMB-high巨噬細(xì)胞影響DC激活T細(xì)胞

利用CytoTalk算法分析GBM中T細(xì)胞與APC-like細(xì)胞間的相互作用，研究完整的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，結(jié)果顯示，T細(xì)胞通過Chemokines、cytokines、co-stimulatory/inhibitory、antigen-presentation通路與單核細(xì)胞、Gpnmb-high巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞相互作用，并且DC細(xì)胞與Gpnmb-high巨噬細(xì)胞共享Cxcl16-Cxcr6趨化因子信號與T細(xì)胞相互作用。為了驗(yàn)證Gpnmb-high巨噬細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制，從GBM腫瘤和正常小鼠中提取F4/80 + GPNMB +巨噬細(xì)胞、D11c + DC和骨髓來源的單核細(xì)胞，然后與na?ve T細(xì)胞共培養(yǎng)（圖6e）；實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與GPNMB+巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞相比，CD11c + DC共培養(yǎng)表達(dá)更高水平的CD69、IFNγ和GZMB，能更好地誘導(dǎo)T細(xì)胞活化（圖6f）；T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果也表明，與GPNMB+巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞相比，CD11c + DC能顯著促進(jìn)T細(xì)胞增殖（圖6g）。綜合以上結(jié)果，確定了關(guān)鍵的GPNMB-high巨噬細(xì)胞亞群是GBM細(xì)胞間通訊的樞紐，不僅誘導(dǎo)PN-MES腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化，而且通過與DC競爭而損害T細(xì)胞激活。Tips：利用細(xì)胞通訊分析篩選潛在細(xì)胞間互作的受體-配體對，結(jié)合細(xì)胞共培養(yǎng)、co-IP和免疫熒光等實(shí)驗(yàn)，可以探究目標(biāo)細(xì)胞類型對特定細(xì)胞功能的影響及機(jī)制。

研究總結(jié)

1、本文通過scRNA-seq數(shù)據(jù)將高度異質(zhì)性的GBM腫瘤細(xì)胞分為MES-like、AC-like，OPC-like和NPC-like亞型；

2、利用細(xì)胞軌跡分析和轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析預(yù)測到由特定TF調(diào)節(jié)的PN到MES細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)換；

3、利用空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)、TCGA數(shù)據(jù)庫、細(xì)胞通訊分析，鎖定到了關(guān)鍵的GPNMB-high巨噬細(xì)胞，在PN-MES細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變中發(fā)揮重要作用；

4、通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分析和細(xì)胞共培養(yǎng)研究，進(jìn)一步揭示了這些源自單核細(xì)胞的GPNMB高巨噬細(xì)胞亞群可能無效地保留T細(xì)胞不被樹突狀細(xì)胞激活，提示未來靶向GPNMB-high巨噬細(xì)胞的聯(lián)合免疫治療可作為有潛力的治療策略。

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